Selectividad iónica y acoplamiento del rotor del sodio flagelar Vibrio.

Jun 16, 2023

Nature Communications volumen 14, número de artículo: 4411 (2023) Citar este artículo

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Las bacterias nadan utilizando un motor flagelar impulsado por unidades de estator. Vibrio spp. son bacterias altamente móviles responsables de diversas enfermedades humanas, cuyos flagelos polares son impulsados ​​exclusivamente por unidades de estator dependientes de sodio (PomAB). Sin embargo, aún no está claro cómo se logra la selectividad iónica, cómo el transporte de iones desencadena la rotación direccional de la unidad del estator y cómo se incorpora la unidad del estator al rotor flagelar. Aquí, hemos determinado mediante microscopía crioelectrónica la estructura de Vibrio PomAB. El mapa de potencial electrostático descubre sitios de unión de sodio que, junto con experimentos funcionales y simulaciones de dinámica molecular, revelan un mecanismo para la translocación y selectividad de iones. Los residuos hidrofóbicos voluminosos de PomA preparan a PomA para que gire en el sentido de las agujas del reloj. Proponemos que un motivo helicoidal dinámico en PomA regula la distancia entre los dominios citoplasmáticos de la subunidad PomA, la activación de la unidad del estator y la transmisión de torque. En conjunto, nuestro estudio proporciona información mecanicista para comprender la selectividad iónica y la incorporación del rotor de la unidad del estator del flagelo bacteriano.

Muchas bacterias rotan los flagelos para impulsar su movimiento. El flagelo se caracteriza por un filamento largo, conectado a través de un gancho flexible a la envoltura celular del motor giratorio integrado (o cuerpo basal), que comprende un rotor y múltiples unidades de estator1,2,3,4. La unidad del estator flagelar utiliza la fuerza motriz iónica transmembrana (IMF) para generar un par mecánico para rotar el flagelo, que es empleado por muchas bacterias para dirigir su locomoción en un ambiente líquido o en superficies viscosas hacia un nicho favorable4,5,6. Impulsado por la unidad del estator, el motor flagelar bacteriano puede girar en sentido horario (CW) y antihorario (CCW), y el cambio entre las dos direcciones está controlado por la señalización de quimiotaxis intracelular7,8. Las unidades del estator son estrictamente necesarias para la rotación del flagelo y, por tanto, la motilidad de las bacterias, pero no para el ensamblaje del flagelo9,10. Además, las unidades del estator se asocian y disocian dinámicamente del rotor11,12,13. Cambiar el número de unidades de estator acopladas permite ajustar el par requerido en relación con la carga mecánica14,15,16,17,18.

Cada unidad del estator está compuesta por dos proteínas de membrana ensambladas como un complejo enterrado dentro de la membrana citoplasmática, en la que sus dominios transmembrana se organizan como un canal iónico19,20. La incorporación de la unidad del estator requiere que su dominio citoplasmático interactúe con el rotor y su dominio periplásmico para unirse a la pared celular bacteriana21. El par generado por la translocación de iones se transmite al rotor mediante interacciones electrostáticas en la interfaz estator-rotor22,23,24,25. Dependiendo de los iones conductores, las unidades de estator se pueden agrupar principalmente en dos subfamilias: la unidad de estator impulsada por H+ (por ejemplo, MotAB) y la unidad de estator impulsada por Na+ (por ejemplo, PomAB)26,27. Además, también se han informado unidades de estator que utilizan potasio e iones divalentes como calcio o magnesio como iones de acoplamiento28,29,30,31. Recientemente, se han estudiado estructuras microscópicas crioelectrónicas (crio-EM) de partículas individuales de unidades de estator MotAB impulsadas por H+32,33, estructuras crio-EM de complejos motores flagelares intactos34,35,36, así como estructuras tomográficas crioelectrónicas in situ (crio-EM). ET) del motor flagelar21,37,38,39,40, proporcionaron vistas estructurales y funcionales detalladas del conjunto de la unidad del estator, la generación de par y la función del motor1. Los datos sugieren fuertemente un modelo rotacional para el mecanismo de acción de las unidades del estator. Tras la dispersión del FMI, se propone que MotA gire alrededor de MotB, que está anclado a la capa de peptidoglicano. Al acoplarse con el rotor, la rotación MotA impulsa la rotación del rotor grande. Se propone un acoplamiento diferencial de MotA con el rotor entre los estados CW y CCW del rotor para formar la base mecánica de la conmutación.

La unidad del estator impulsada por Na+ es particularmente importante para las especies de Vibrio, incluidas las patogénicas (p. ej., V. cholerae, V. alginolyticus), ya que sus flagelos polares sólo pueden ser impulsados ​​por el gradiente transmembrana de Na+, y la motilidad de muchos Vibrios se ha visto afectada. vinculado a su virulencia, formación de biopelículas y dispersión41,42,43. Sin embargo, a nivel molecular, no está claro cómo las unidades del estator discriminan entre diferentes tipos de iones y la potencia de rotación del motor flagelar. Además, la unidad del estator impulsada por Na+ es un tema ideal para investigar la selectividad iónica y los mecanismos de translocación de la unidad del estator. Como un ion Na+ interactúa más con los electrones que un protón en el microscopio crioelectrónico, podría visualizarse más fácilmente en un mapa crio-EM de alta resolución. Finalmente, los iones de sodio son más fáciles de detectar y manipular que los protones44.

Por lo tanto, una estructura atómica de la unidad del estator impulsada por Na+ es crucial para dilucidar el mecanismo por el cual la unidad del estator distingue los iones y acopla el transporte de iones en su rotación. Con este fin, determinamos estructuras crio-EM de Vibrio PomAB (de V. alginolyticus; denominado VaPomAB) tanto en ambientes detergentes como lipídicos, con una resolución del mapa local que alcanza ~ 2 Å. La estructura de alta resolución nos permitió localizar sitios de unión de iones Na+ y reveló las bases estructurales y mecanísticas de la selectividad iónica. Mostramos a nivel molecular cómo la unidad del estator logra su rotación monodireccional mediante el transporte de iones. Además, identificamos un motivo helicoidal en la región C-terminal de PomA (CH) que es esencial para la función de la unidad del estator. Validamos nuestros resultados estructurales mediante extensos análisis mutagenéticos y simulaciones de dinámica molecular MD. Finalmente, proponemos un papel para la disposición asimétrica del dominio citoplasmático de la unidad del estator en la generación de par y el mecanismo de montaje/desmontaje de la unidad del estator en el rotor.

VaPomAB intacto es un complejo de forma anisotrópica y muestra una orientación preferencial de las partículas en el hielo vítreo (Fig. 1, Fig. 2 complementaria). Para mejorar la homogeneidad de la muestra, modificamos el protocolo de purificación de proteínas y codificamos un sitio de proteasa en el gen PomB después de la región del tapón, lo que permitió la eliminación del dominio de unión al peptidoglicano (PGB) de PomB durante la purificación de proteínas (Fig. 1, Fig. Suplementaria). 1b). Para superar la orientación preferida, agregamos el detergente zwitteriónico CHAPSO para aleatorizar la orientación de las partículas durante la preparación de la rejilla EM45,46. El análisis de una sola partícula arrojó una resolución general de VaPomAB en detergente de lauril maltosa neopentilglicol (LMNG) de ~2,5 Å, con el mapa crio-EM de calidad suficiente para construir un modelo atómico para la mayor parte del complejo proteico. La resolución local correspondiente al dominio transmembrana interno se acerca a 2 Å, con una densidad clara para moléculas no proteicas, lo que nos permite modelar moléculas e iones de agua, así como isómeros de cadenas laterales de residuos (Fig. 1, Figs. Suplementarias 2-4 y Tabla complementaria 1).

un mapa Cryo-EM de VaPomAB. Las subunidades PomA (púrpura, naranja, amarillo, verde y rojo) rodean a las subunidades PomB (blancas y negras) vistas desde el plano de la membrana. Las líneas discontinuas representan los límites aproximados de la membrana interna. b Mapa Cryo-EM de VaPomAB visto desde el lado periplásmico. c Representación del modelo de cinta de VaPomAB. Las subunidades están coloreadas como en (a). d Modelo VaPomAB visto desde el lado periplásmico. e Mapa de resolución local de VaPomAB visto desde una sección transversal como se indica en (a). f Diagrama de topología y elementos estructurales secundarios de las subunidades VaPomA (morado) y VaPomB (negro). La elipse gris indica el dominio de unión a peptidoglicano (PGB) de PomB. Periplasma PP, membrana interna IM, citoplasma CP, peptidoglicano PG, transmembrana TM, hélice H.

PomAB reúne la característica forma de campana de la familia de unidades de estator, con una estequiometría de subunidad y arquitectura general conservadas de 5:2. Cinco moléculas de PomA se organizan pseudosimétricamente alrededor de dos PomB, y cada subunidad de PomA comprende cuatro hélices transmembrana (TM1-TM4) plegadas en dos capas radiales. Los TM3 y TM4 forman una capa interna que recubre los PomB TM dimerizados. Los TM1 y TM2 rodean periféricamente, junto con las hélices de la interfaz periplásmica (PI) de PomA y las hélices de la interfaz citoplasmática (CI), estableciendo una capa externa, con un lado empaquetado contra la capa interna y el otro lado interactuando hidrofóbicamente con la bicapa lipídica. El TM1 resuelto de un PomA hace contacto prominente con el TM2 de la subunidad adyacente. El dominio citoplasmático de PomA contiene un haz de hélice compacto (H1-H4), una región donde el torque se genera mediante la coincidencia electrostática con la hélice de torque FliG del rotor47. El mapa crio-EM de PomAB también revela una hélice corta después de PomA H4, que designamos como motivo CH (hélice C-terminal), unida a la hélice CI de una subunidad vecina de PomA (Fig. 1f). Los motivos obstruidos de dos cadenas PomB están completamente resueltos en nuestra estructura PomAB, donde se ubican en la parte superior del lado periplásmico de la unidad del estator, de acuerdo con un estado autoinhibido obstruido. También notamos que cada extremo del motivo del tapón interactúa con la hélice PI de PomA. Proponemos que esto hace que los residuos N-terminales (residuos 1 a 21) de dos subunidades PomA se desordenen, ya que no se resuelven en nuestro mapa crio-EM (Figura complementaria 5c).

El motivo del tapón PomB es una hélice α anfipática corta, que sigue a la hélice TM. La eliminación del motivo del tapón da como resultado la entrada de iones en el citosol de la célula y, por lo tanto, provoca la inhibición del crecimiento celular cuando se sobreexpresa48,49. Estudios anteriores mediante experimentos de mutagénesis y entrecruzamiento han mapeado residuos críticos involucrados en las interacciones entre el motivo del tapón PomB y PomA48,50. En la estructura de PomAB, la TM de PomB está conectada a la hélice del tapón a través de un conector de cuatro residuos (Fig. 2c), lo que hace que la hélice del tapón gire ~ 145 °, lo que hace que su extremo C apunte hacia la membrana citoplasmática. Los dos conectores cortos establecen una interacción lateral mediante cuatro enlaces de hidrógeno de la columna vertebral, organizando los motivos del tapón como una configuración de modo trans en relación con las hélices de PomB TM, con una simetría de pseudoespejo perpendicular a la membrana celular (Fig. 2a, d). Los motivos de enchufe de las unidades de estator impulsadas por sodio y protones comparten un patrón de aminoácidos similar (Fig. 1b complementaria) que comprende un lado hidrofóbico que realiza su interacción principal con la propia unidad del estator y un lado hidrofílico que está expuesto en la mayoría de las partes al periplásmico. disolvente espacial (Fig. 2b). El entorno de contacto del motivo del tapón PomB lo contribuye principalmente una hendidura enmarcada por el lado periplásmico de TM4, TM3 y la hélice PI de una subunidad PomA, y el lado periplásmico de TM3 y TM4 de la subunidad PomA adyacente. Tres residuos del motivo del tapón (I50, M54 y F58) se insertan profundamente en esta hendidura, estableciendo interacciones hidrofóbicas (Fig. 2e, f). Además, el anillo aromático PomB F47 está intercalado entre el anillo de pirrolidina de P172 y la cadena lateral de M169 de PomA, a través de interacciones CH-π, estabilizando aún más el motivo del tapón (Fig. 2f). La estequiometría 5: 2 de la unidad del estator crea entornos de unión desiguales para los dos motivos del tapón, como se examina calculando el área enterrada de la superficie y las energías libres de los residuos que forman la hélice del tapón (residuos 44-58, Fig. 2g, h). Por lo tanto, especulamos que durante la activación de la unidad del estator, liberar el motivo del enchufe de la unidad del estator no es un proceso simétrico. En cambio, un motivo de tapón con energía de unión relativamente baja probablemente se desprenda primero de su sitio inhibidor, y luego se inducirá la liberación del segundo motivo de tapón. PomB G59 marca el final del motivo del tapón y ejerce directamente el efecto sobre la conformación de la hélice PomA PI. Descubrimos que cada uno de los motivos del tapón PomB induce dos conformaciones diferentes de la hélice PomA PI que une PomA TM1 y TM2; una conformación es similar a las observadas en las otras tres subunidades de PomA, y la otra conformación extiende TM2 un giro helicoidal más que involucra residuos de L26 a V32 (Figura complementaria 5c).

un VaPomAB en su estado autoinhibido, visto desde el plano de la membrana, con PomB mostrado como cintas (blanco y negro) y PomA como una representación de superficie semitransparente. Los residuos de aspartato D24 de ambos PomB TM se indican y se muestran como barras. b Vista superior de VaPomAB con PomB mostrado como cintas y PomA como una representación de superficie coloreada según su hidrofobicidad. c Vista superior de VaPomAB. Las subunidades PomA se muestran como una representación de superficie y las subunidades PomB se muestran como cintas, coloreadas como en la Fig. 1a. d Vista de primer plano desde el lado periplásmico de las interacciones de los enlazadores (Phe39-Asp43) que conectan motivos de enchufe PomB y TM (corresponde al cuadro amarillo en (c)). Los enlaces de hidrógeno se representan como líneas discontinuas. e Motivo del enchufe del entorno de encuadernación PomB(2) (cuadro negro en (c)). f Motivo de enchufe del entorno de encuadernación PomB(1) (cuadro rojo en (c)). g, h Área enterrada de interfaz calculada y energía libre de motivos de enchufe PomB.

La dinámica de las hélices de PomA PI que surgen de la interacción del motivo del tapón PomB presumiblemente impulsa la flexibilidad del TM1 correspondiente, ya que este último no pudo resolverse en dos de las subunidades de PomA. La estructura de alta resolución de PomAB se determinó en un entorno de micelas de detergente, lo que plantea la posibilidad de que las moléculas de detergente puedan tener un impacto en la conformación de PomAB, particularmente en las hélices enfrentadas a la membrana, incluida la TM1 desordenada de dos subunidades de PomA. Para aclarar esto e imitar mejor el entorno nativo de la unidad del estator, reconstituimos VaPomAB en nanodiscos de proteína de andamio de membrana 1D1 (MSP1D1), así como VaPomAB de longitud completa, no escindido, en nanodiscos de saposina, con lípidos polares de E. coli, y determinó la resolución del mapa, a 3,9 Å y 6,3 Å, respectivamente (Figuras complementarias 3 y 4). En ambos casos, pudimos rastrear todos los elementos de la estructura secundaria del complejo PomAB, excepto las dos hélices PomA TM1 (Figuras complementarias 5f, 5i). La comparación de la estructura de PomAB LMNG con la estructura reconstituida con lípidos de MSP1D1 no reveló diferencias conformacionales importantes (desviación cuadrática media de 0,642 Å, 1312 átomos de Cα alineados) que podrían surgir de los artefactos del detergente. Esto indica que la flexibilidad de esas dos hélices TM1 en la unidad del estator inactiva es probablemente intrínseca, lo que podría ser funcionalmente importante durante la activación de la unidad del estator.

Las unidades de estator utilizan iones específicos para impulsar la rotación del motor flagelar. Cada MotB/PomB TM contiene un aspartato (D24 en PomB) que es responsable de la unión y translocación de los iones entrantes desde el espacio periplásmico al lado citoplasmático (Fig. 2a). Sin embargo, este aspartato se conserva universalmente entre las familias de unidades de estator (Figura complementaria 1b), lo que oscurece la base estructural y mecánica de la selectividad iónica. La estructura de PomAB muestra que el D24 de dos cadenas PomB se encuentra en entornos diferentes; D24 de la cadena 1 de Pom B interactúa con PomA, al que nos referimos como estado comprometido; mientras que D24 de la cadena 2 de PomB apunta hacia el dominio citoplasmático y rompe la interacción con PomA, a lo que nos referimos como estado desconectado (Fig. 3a). El examen del mapa de densidad de alta resolución en las proximidades de estos dos aspartatos revela densidades sin residuos. En el sitio 1, cerca del PomB D24 comprometido (cadena PomB 1), la densidad adicional está coordinada por oxígenos de los grupos hidroxilo de la cadena lateral de PomB T21 y D24, y los grupos carbonilo de la columna vertebral de los adyacentes PomA P151 y PomB G20. Una quinta interacción de coordinación se realiza mediante un enlace de hidrógeno de una molécula de agua cerca de PomA A190, y la distancia promedio entre el centro de la densidad y los oxígenos asociados es de 2,88 Å (Fig. 3b). En el sitio 2, cerca del PomB D24 desconectado, que es más flexible como lo indica la densidad EM ligeramente borrosa de su cadena lateral ácida, una densidad globular está bien coordinada por átomos de oxígeno aportados exclusivamente por PomA TM3 y TM4: grupos hidroxilo de cadena lateral de T158, T185 y T186, y grupos carbonilo de la columna vertebral expuestos de G154 y A182, con una distancia promedio entre el centro de densidad y el oxígeno asociado de 2,33 Å (Fig. 3c). Dados los entornos químicos locales favorables del catión en estos dos sitios, y especialmente la geometría típica de coordinación de Na+51 en el sitio 2, modelamos estas densidades como iones Na+, que eran los cationes más predominantes en el tampón de purificación de proteínas. Para validar aún más el modelo, realizamos dos simulaciones MD explícitas de todos los átomos con disolvente (1 µs para cada una) y observamos que el ion Na+ en el sitio 1 era muy estable, pero el otro ion Na+ en el sitio 2 se movió rápidamente a un sitio intermedio formado. por la cadena lateral de D24, T158 y T186 y posteriormente a una ubicación simétrica al sitio 1, y finalmente liberado al espacio citoplasmático (Figuras complementarias 6c-d y Película complementaria 1). También observamos una dinámica conformacional significativa de algunos residuos polares alrededor del sitio 2, especialmente T158, T186 en la cadena PomA 5 y D24 en la cadena PomB 2 (Figuras complementarias 6a y 7). Por el contrario, T186 en la cadena 2 de PomA y D24 en la cadena 1 de PomB en el sitio comprometido fueron, sin embargo, mucho más estables (Figuras complementarias 6a-b y 7d).

una vista en sección transversal (correspondiente a la vista en el panel izquierdo y girada 90°) de los sitios de unión de iones Na+ (esferas cian) en las proximidades de los dos Asp24 de PomB. b Detalles del sitio de unión del ion Na+ cerca de PomB(1) comprometido con Asp24. Para mayor claridad, las densidades EM correspondientes solo se superponen en la región de PomB(1) Gly20-Asp24, el ion Na+ y la molécula de agua. Los enlaces de hidrógeno se indican como líneas discontinuas con distancias en angstroms. c Detalles del sitio de unión del ion Na+ cerca de PomB(2) Asp24 desconectado. La densidad EM se superpone al ion Na+. d Vía de translocación de iones Na+ (línea discontinua con flecha). Se indican los canales periplásmicos y citoplasmáticos, con la superficie coloreada por el potencial electrostático (cargada positivamente, azul; cargada negativamente, rojo). Los átomos de Cα de los residuos que forman la supuesta puerta hidrofóbica, de las glicinas que forman el motivo de cremallera de glicina y de PomB (2) S27 y D24 Cα se indican y se muestran como esferas e, Vista superior de la vía de translocación de iones Na+. f Entorno de unión de iones de sodio VaPomAB cerca del sitio comprometido. La superficie de PomA está coloreada por hidrofobicidad. g Vista similar a la de (f), pero en la unidad de estator impulsada por protones CjMotAB. h Vista similar a la de (f), pero en la unidad de estator impulsada por protones BsMotAB. i Comparación de la capacidad de motilidad de las construcciones VaPotAB y los mutantes puntuales de los residuos cerca del sitio de unión del ion Na+ o de los residuos a lo largo de la vía de translocación de Na+. “∆MotAB VC” significa un vector vacío transformado en una cepa mutante de Salmonella enterica que carece de su MotAB de tipo salvaje. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

La identificación de los sitios de unión de Na+ a partir de la densidad EM y la dinámica conformacional asimétrica nos llevó a especular que al menos parte del filtro de selectividad de iones PomAB anida dentro de la subunidad PomA, y esos tres residuos de treonina (PomA T158, T185 y T186), que se conservan en todas las unidades de estator impulsadas por sodio (Figura complementaria 1a), explican la selectividad y el transporte de los iones Na +. Es de destacar que el T158 de la cadena 2 de PomA, cerca del PomB D24 comprometido, no contribuye directamente a la unión de Na+. En cambio, orienta su cadena lateral para establecer un enlace de hidrógeno con PomB D24 (Fig. 3b), lo que indica que se produce un cambio conformacional local durante el transporte de iones Na+. De manera similar, en el mismo sitio de las otras tres subunidades PomA, no observamos densidades correspondientes a un ion Na+ (Figuras complementarias 8a-f), lo que sugiere que solo se suministraría un ion Na+ durante cada paso de rotación de la unidad del estator.

Para investigar el papel funcional de los residuos clave para la selectividad iónica de la unidad del estator impulsada por Na+, primero diseñamos un PomAB quimérico (rebautizado como VaPotAB) reemplazando PomB PGB con S. enterica MotB PGB, una estrategia similar a la utilizada en estudios previos52. ,53. Un plásmido que codifica VaPotAB confirió un fenotipo móvil en placas de agar blando cuando se transformó en una cepa mutante de Salmonella enterica que carece de su MotAB de tipo salvaje (Fig. 3i). Luego generamos mutaciones puntuales en VaPotAB para evaluar la importancia de las tres treoninas clave en la rotación del motor flagelar mediante el examen del fenotipo de motilidad. Descubrimos que la sustitución de cualquiera de estas tres treoninas por alaninas elimina la motilidad bacteriana, lo que confirma la importancia de estos residuos para la función de la unidad del estator (Fig. 3i). Por lo tanto, la cavidad de unión de iones Na+ parece un requisito estricto para la selectividad iónica. Observamos que un ion K+, que tiene un radio mayor que el ion Na+ (1,52 Å frente a 1,16 Å) y una distancia promedio de enlace ligado de alrededor de 2,7 a 3,2 Å, no puede acomodarse en esta cavidad. Para cuantificar la selectividad de Na+ en esta cavidad, realizamos cálculos de perturbación de energía libre y encontramos que Na+ tiene una energía libre de unión menor que K+ en 4,37 ± 0,7 kJ/mol, lo que indica que esta cavidad prefiere Na+ sobre K+. Por otro lado, el H+ es demasiado pequeño para llenar esta cavidad y la energía es desfavorable para que un H3O+ esté ligado con un número de coordinación de cinco. Por lo tanto, PomAB no puede utilizar K+ y H+ (o H3O+) como iones de acoplamiento. Los iones divalentes, como Ca2+ y Mg2+, que necesitarían más residuos cargados negativamente para ser neutralizados y coordinados, probablemente tampoco se vean favorecidos en esta cavidad.

Además, comparamos la estructura PomAB con las estructuras de unidades de estator impulsadas por H+ disponibles, C. jejuni MotAB y B. subtilis MotAB, para explorar la razón por la cual las unidades de estator impulsadas por H+ no pueden usar sodio u otros metales alcalinos como iones de acoplamiento. En la parte de la estructura de la unidad del estator impulsada por H+ que es equivalente al correspondiente sitio de unión de Na+ 2 en PomAB, dos treoninas (T158 y T185) son reemplazadas por alanina, lo que carece de oxígeno en esta cavidad, lo que probablemente impide la unión de iones de metales alcalinos. (Figuras complementarias 1a y 8g – i). En la posición equivalente del PomB acoplado a D24, cerca de la molécula de agua que coordina el sitio 1 de unión de Na+, la unidad del estator impulsada por H+ contiene un residuo de isoleucina en lugar de una alanina o un residuo polar, lo que hace que esta región sea hidrófoba y no favorece una coordinación de iones de metales alcalinos (Fig. 3f – h). Por lo tanto, ambos sitios en la unidad del estator impulsado por H+ carecen del entorno de contacto para los iones de metales alcalinos, lo que apoya la idea de que la variabilidad de los residuos en PomA/MotA tiene una gran influencia en la selectividad iónica.

El análisis de la interfaz de ensamblaje de la estructura entre las subunidades PomA y PomB a nivel periplásmico revela que esta interfaz de contacto interna está revestida principalmente por residuos hidrofóbicos (Fig. 4a), con un espesor que abarca alrededor de cuatro vueltas helicoidales (de PomB S27 a S38). Por lo tanto, es poco probable que en esta región se forme un canal acuoso que media el flujo de iones Na+ a través de PomAB. Más bien, se podría delinear una posible vía de translocación de Na+ en función de la estructura de PomAB y nuestro ensayo de motilidad funcional. Se extiende desde el sitio de unión de Na+ 2 hasta el espacio periplásmico, delineado en un lado por la hélice PI y el comienzo de la hélice TM2 de la misma subunidad PomA y en el otro lado por el final de TM1 de la subunidad PomA adyacente (Fig. 3d, mi). La vía de translocación de iones en esta parte contiene una puerta hidrofóbica (Fig. 3d), que probablemente elimina la capa de hidratación del Na+ entrante; y hacia el espacio periplásmico, la vía de translocación está revestida por varios residuos polares, como D31, T33 y S34, y muchos de ellos están conservados (Figuras complementarias 9b-c). La vía de translocación de Na + llega a PomB D24 y a la luz interna del dominio citoplasmático de PomA, donde el potencial electrostático de la superficie es muy negativo (Fig. 4d) y, junto con el extremo N de PomB que alberga varios residuos cargados negativamente (Fig. 4d complementaria) . 1b), podría atraer el Na+ entrante. También encontramos que PomA TM3 contiene un motivo GXXGXXXG (residuos G154-G161) estrictamente conservado, una estructura típica de "cremallera de glicina" que contribuye a la formación de canales en muchas proteínas de membrana54. Las glicinas del motivo 'cremallera de glicina' se enfrentan a la interfaz de ensamblaje de TM3 y TM4, manteniendo el filtro de selectividad de Na+ en una posición media y, junto con el P151 conservado, contribuyendo a la elasticidad conformacional de la cadena principal de esta región cuando un ion Na+ pasa a través de TM3 y Hendidura TM4. La sustitución del residuo de glicina por leucina en la 'cremallera de glicina' elimina la motilidad bacteriana (Fig. 3d, Figs. complementarias 1a y 14a).

una interfaz de ensamblaje VaPomAB en los niveles del espacio periplásmico y del dominio transmembrana, con una superficie coloreada según la hidrofobicidad. Para mayor claridad, las dos cadenas frontales se eliminan y las cadenas PomB se muestran como una cinta. b Los isómeros conformacionales de M155 cerca de PomB activaron D24 y desconectaron D24. Las densidades EM están superpuestas en la cadena lateral de M155. c Comparación de la capacidad de motilidad de las construcciones VaPotAB y los mutantes puntuales del residuo M155 y los residuos de PomB cerca de M155. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen. d Isómeros conformacionales de M155 vistos desde la parte superior de la membrana. El círculo sólido indica la dirección de rotación de PomA alrededor de PomB. Un posible choque que ocurriría si PomA girara en sentido antihorario alrededor de PomB se indica con un heptágono rojo.

A partir de nuestras simulaciones explícitas de MD con solvente, también observamos que en el lado periplásmico, la cadena lateral de T33 era conformacionalmente dinámica y estaba rodeada por moléculas de agua, que ocasionalmente podían difundirse al espacio al lado de la cadena lateral de T185 (Figuras complementarias 7c y Película complementaria 2), por lo tanto, proponemos que la bolsa de hidratación formada por T33 y algunos otros residuos polares es el sitio de entrada de la ruta de translocación de Na+ propuesta. Tenga en cuenta que no observamos una ruta de hidratación continua o translocación de Na+ para conectar el lado periplásmico y el sitio 2 de Na+, probablemente porque esta estructura estaba en el estado obstruido autoinhibido y el tiempo de simulación (1 µs) también fue mucho más corto que el Calendario de apertura del canal.

Habiendo analizado el mecanismo de selectividad iónica de la familia de unidades del estator en el contexto del mapa de alta resolución de PomAB, a continuación buscamos comprender la base estructural de la dirección de rotación de la unidad del estator. Los estudios de crio-ET en cuerpos basales de V. alginolyticus y Borrelia burgdorferi revelan que cuando el rotor gira en la dirección CCW, su componente de anillo C FliG interactúa con el lado proximal del dominio citoplásmico de la unidad del estator (el lado que mira hacia el eje del motor); mientras que, cuando el rotor está bloqueado y gira en la dirección CW, FliG interactúa con el lado distal del dominio citoplasmático de la unidad del estator. El cambio direccional del rotor de rotación CCW a CW requiere remodelación y expansión del anillo C cambiando su conformación al recibir una señal de quimiotaxis intracelular38,39. Por lo tanto, la unidad del estator puede impulsar la rotación en sentido horario y antihorario del motor flagelar con una posición relativamente fija anclándose a la capa de peptidoglicano a través del motivo PGB.

Visto desde el plano de la membrana interna, observamos que la voluminosa cadena lateral hidrofóbica de M155 de la cadena 2 de PomA está orientada horizontalmente al PomB D24 acoplado (Fig. 4b), lo que revela que M155 obstaculizará estéricamente la rotación de PomA a CCW alrededor de PomB en el sitio D24 comprometido (Fig. 4d). Mientras tanto, M155 de la cadena 4 de PomA eleva su cadena lateral para caminar sobre el D24 desacoplado, para lo cual la interacción con PomA está casi ausente, lo que proporciona el espacio necesario para que D24 recopile el ion Na+ de la cavidad de selectividad (Fig. 4b, d). . Nuestra hipótesis es que la voluminosa cadena lateral de la posición 155 de PomA es el punto de "refuerzo" de rotación direccional de la unidad del estator. Para probar esta hipótesis y verificar la importancia de la voluminosa cadena lateral en esta posición, primero sustituimos este residuo de metionina por alanina. La mutación M155A abolió la motilidad bacteriana. Por el contrario, la sustitución de metionina por leucina, un residuo en la posición equivalente que se ve a menudo en las unidades de estator impulsadas por H+, retuvo el 80% de la motilidad. El aumento del tamaño de los residuos cerca de PomA M155 de PomB (PomB F22Y y L25F) afectó la motilidad (Fig. 4c). Por lo tanto, nuestro análisis estructural y datos funcionales confirman que se requiere un residuo con una cadena lateral voluminosa cerca del sitio de acoplamiento iónico (D24 en PomB) para permitir la dirección de rotación correcta de la unidad del estator. Su isómero conformacional (Figura 10 complementaria), probablemente inducido por el reordenamiento estructural local durante la activación de la unidad del estator, es necesario para lograr flexibilidad en esta región para el transporte de iones. Este voluminoso residuo hidrofóbico se conserva no sólo en las unidades de estator flagelar, sino también en otros motores rotativos 5:255, lo que sugiere un mecanismo de "refuerzo" de rotación direccional similar (Figura complementaria 11). La unidad del estator es, por tanto, un motor giratorio CW preestablecido, que está firmemente bloqueado por la conformación en modo trans del motivo del enchufe PomB en el lado periplásmico antes de incorporarse al rotor. La geometría de la unidad del estator no favorecerá un modelo en el que PomA gira en sentido antihorario alrededor de PomB, cuando la fuerza motriz del ion se invierte, debido a los choques estructurales (Fig. 4d) y al potencial electrostático negativo de la luz interna citoplásmica de PomA. Esto es consistente con los primeros experimentos que muestran que la unidad del estator se inactiva cuando el FMI se disipa o se invierte56, y que una mayor concentración de sodio en el citoplasma inhibe la rotación de PomAB49.

El dominio citoplasmático de la unidad del estator juega un papel crucial durante la incorporación del rotor, la generación de par y el desmontaje del rotor1,44. El dominio citoplasmático de cada subunidad PomA contiene cuatro hélices cortas que son casi verticales a la membrana interna. Rodean periféricamente la parte intracelular de las hélices PomA TM3 y TM4 y juntas forman un haz helicoidal compacto que sobresale ~ 35 Å hacia el citosol (Fig. 5a-c). Los dominios citoplasmáticos de cinco subunidades PomA divergen hacia su extremo intracelular, y la resolución local de esta región disminuye considerablemente en comparación con el TMD. Esto está en línea con la distribución del factor B del modelo, donde el dominio citoplasmático de PomAB tiene un valor de factor B más alto (Figura 12 complementaria), lo que refleja la flexibilidad de esta región. La unidad del estator giratorio genera par haciendo coincidir los residuos cargados complementarios con la hélice de par del rotor FliG. Se predice que este modo de generación de torque se conserva en todas las especies bacterianas22,24,57. Definimos la interfaz de unión de hélice de par FliG de la unidad del estator de la siguiente manera: los residuos cargados positivamente de una subunidad PomA contribuyen a la cara principal o cara (+), y los residuos cargados negativamente de la subunidad PomA vecina contribuyen principalmente a la cara complementaria o (-) cara (Fig. 5b, c). La estructura de PomAB nos permite mapear las ubicaciones de los residuos clave involucrados en la interacción estator-rotor. Encontramos tres residuos cargados positivamente de H1 y H4 en la cara (+), R88, K89 y R232, y dos residuos cargados negativamente de H2 y H3 en la cara (-), D114 y E96, que cuando se suprime la carga o revertidos, afectan en gran medida la motilidad (Fig. 5h). Es importante destacar que la carga de R88 en la cara (+) y de D114 y E96 en la cara (-), cuyas cadenas laterales se proyectan hacia la unión entre subunidades de PomA, son indispensables para la motilidad, lo que confirma que ambos lados (+) y (-) de Los PomA son necesarios y están directamente involucrados en las interacciones con la hélice de torsión FliG. Además, R232 establece un puente salino entre dominios con el residuo D85, que probablemente no solo estabiliza la organización del haz de hélices, sino que también contribuye a la unión de la hélice de torsión FliG. La mutación R232A afecta la motilidad y la mutación D85A da como resultado un fenotipo de ganancia de función (Fig. 5b).

un potencial electrostático del dominio citoplasmático de PomAB. b Ubicaciones de los residuos clave responsables de la unión de la hélice de torsión FliG, destacando los residuos cargados positivamente de la interfaz principal. c, similar a b, pero resaltando los residuos cargados negativamente de la interfaz complementaria. d Se muestra el dominio C-terminal de VaFliG (basado en modelos de homología) que contiene la hélice generadora de torque y se indica su longitud. e Interacciones entre la hélice PomA CH y la hélice CI. Un sitio sin interacción se resalta y se rodea con una línea continua. f Imagen vista desde el dominio citoplasmático. Se dan las distancias entre el centro de masa de los residuos K89, R88 y el centro de masa de los residuos D114, E96 de subunidades PomA adyacentes. g Interacciones detalladas entre el motivo CH y la hélice CI. Los residuos involucrados en las interacciones se muestran como palos. h Comparación de la capacidad de motilidad de las construcciones VaPotAB y los mutantes puntuales de los residuos implicados en la interacción de la hélice de torsión FliG o el truncamiento C-terminal de PomA. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Inesperadamente, encontramos un motivo helicoidal (CH) justo después de la hélice H4 en la parte C-terminal de PomA. El motivo CH corre paralelo al plano de la membrana y se une a la hélice CI de una subunidad PomA vecina. En cuatro subunidades de PomA, pudimos rastrear todos los motivos CH desde el residuo K246 hasta su extremo C-terminal D253, con el contacto entre CH y CI mediado principalmente por interacciones electrostáticas e hidrofóbicas (Fig. 5g). El motivo CH restante está desordenado, sin que se observe ninguna densidad destacada (Fig. 5e). Este motivo CH desordenado probablemente se debe a la asimetría del conjunto PomAB, donde hay dos subunidades PomA en un lado de los motivos tapón PomB y tres en el otro lado y hay menos espacio para que este motivo CH interactúe con la hélice vecina PomA CI. . El desprendimiento de CH de CI en un sitio entre subunidades da como resultado que los dominios citoplásmicos de PomA formen un pentágono irregular, como se muestra al medir las distancias de los residuos de carga responsables de la unión de la hélice de torque de FliG (el centro de masa de K89 y R88 al centro de masa de D114 y E96) (Fig. 5f). La región C-terminal de PomA está menos conservada en longitud y secuencia entre los subtipos de unidades de estator (Figura complementaria 1b). Hicimos un truncamiento del extremo C-terminal de PomA y descubrimos que el truncamiento del motivo PomA CH abolió por completo la motilidad (Fig. 5h). Con base en estos hallazgos y nuestro análisis estructural, confirmamos que el motivo PomA CH y la interacción CH-CI son fundamentales para mantener la función de la unidad del estator.

Desde que se reveló por primera vez en especies de Vibrio que sus motores flagelares polares son impulsados ​​por la fuerza motriz del sodio19,58, la unidad del estator impulsada por Na+ ha sido objeto de intensas investigaciones funcionales y estructurales durante décadas59. Si bien la unidad de estator de V. alginolyticus (VaPomAB) ha servido como prototipo para la superfamilia de unidades de estator impulsadas por Na+, hasta ahora ha demostrado ser refractaria al análisis estructural. Aquí determinamos una estructura de alta resolución de la unidad del estator impulsada por Na+ para llenar este vacío de conocimiento.

La conformación trans de los motivos del enchufe parece ser una característica universal entre la familia de unidades del estator y su configuración estructural explica cómo su organización restringe fuertemente la rotación de la unidad del estator (Figura complementaria 13). Los motivos de tapón también evitan la entrada de iones al dominio citoplasmático antes de que la unidad del estator se incorpore al rotor. Sus distintos entornos de interacción causados ​​por la estequiometría desequilibrada de la subunidad PomA5: PomB2 también sugieren su liberación asimétrica durante la interacción estator-rotor. La señal que promueve la liberación del motivo del tapón periplásmico probablemente se desencadena por la interacción entre la unidad del estator y el rotor del citoplasma tras la incorporación de las unidades del estator al motor, y la ruta de transmisión de la señal probablemente sea a través de hélices periféricas transmembrana de PomA, en particular aquellas dos dinámicas PomA TM1. hélices. La liberación del motivo del tapón podría entonces facilitar la dimerización de los motivos PomB PGB, que pueden alcanzar y anclarse a la pared celular mediante el reconocimiento de los componentes del peptidoglicano por la arboleda interfacial de PGB dimerizada, y esto producirá una tensión espacial que impedirá la nueva unión del motivo del tapón liberado al activado. unidad de estator. Por lo tanto, sólo las unidades de estator desconectadas incorporadas en el rotor representan sus estados completamente activados. De hecho, no pudimos purificar el PomAB desconectado después de eliminar el motivo del enchufe PomB. Probablemente, el complejo PomAB de eliminación del tapón no se ensambló bien y fue tóxico para las células debido a la fuga de iones, y el PomAB desenchufado es más estable tras la incorporación del rotor.

La vía de permeación de iones identificada en la estructura de PomAB proporciona una ventaja energética al acortar la ruta de translocación de iones de sodio desde el lado periplásmico hasta el residuo clave que acepta iones PomB D24. PomB S27, un residuo polar justo encima de D24, puede aumentar la accesibilidad al disolvente (Fig. 3d). Además, los residuos hidrófobos que se encuentran en la interfaz del conjunto periplásmico de PomA y PomB pueden bloquear el flujo de iones de regreso al espacio periplásmico y también pueden estabilizar la unidad del estator evitando que se desmorone durante la permanencia de la unidad del estator en el rotor (Fig. 4a). Un estudio reciente demostró que cuando E. coli MotAB se reemplaza con un PomAB diseñado (PomB PGB reemplazado con E. coli MotB PGB), en un ambiente bajo en Na+, el PomAB diseñado puede adquirir rápidamente mutaciones, que restauran la motilidad bacteriana60 y reflejan la adaptabilidad. de la unidad del estator. Esto es consistente con nuestros resultados, donde esas mutaciones en VaPotAB (PomB PGB reemplazadas por S. enterica MotB PGB) otorgaron a la unidad del estator un fenotipo de ganancia de función en S. enterica (Figuras complementarias 14a-b). La mayoría de esos sitios de mutación residen cerca de la cavidad de selectividad iónica (Fig. 14c-d complementaria), incluidos PomB G20, L28 y PomA L183, y tras la mutación pueden modular la especificidad iónica, lo que probablemente permite que la unidad del estator utilice tanto Na+ como H+ como iones de acoplamiento. Es de destacar que en la unidad del estator impulsada por H+ C. jejuni MotAB, el sitio equivalente de PomA L183 es ​​la fenilalanina (CjMotA186), cuya cadena lateral adopta dos conformaciones en la unidad del estator activada, lo que afecta la eficiencia de la translocación de H+33. También notamos que PomB L36Q tiene un fenotipo de ganancia de función. En la estructura PomAB tapada, la cadena PomB 1 L36 interactúa hidrofóbicamente con el motivo del tapón F47 de la cadena PomB 2 (no la cadena PomB 2 L36 con la cadena PomB 1 F47, debido al ensamblaje asimétrico) (Figuras complementarias 12c-d). La mutación L36Q posiblemente disminuye la energía de unión del motivo del enchufe y hace que la unidad del estator sea más activable. Además, es poco probable que PomB L36 recubra la ruta de translocación de iones propuesta previamente en la que forma la puerta de deshidratación con residuos hidrofóbicos cercanos, ya que el mutante L36A tiene la misma motilidad que el fenotipo de tipo salvaje (Figura complementaria 14a).

Las interacciones CH-CI observadas y el desprendimiento en un sitio, así como la forma pentagonal irregular del dominio citoplasmático de PomA, probablemente contribuyan al proceso de ensamblaje de la unidad del estator en el rotor. Proponemos el siguiente modelo para la unidad de estator dinámica unida al rotor, en el que la unidad de estator se orienta aleatoriamente hacia el rotor y "mide" la longitud de la hélice de par FliG. Una vez que las caras principal y complementaria del dominio citoplasmático de PomA atrapan la hélice de torque FliG, posiblemente a través de (uno de) los dos sitios más cortos entre cinco, que se ajustan mejor a la longitud de la hélice de torque FliG (Fig. 5d, f), la unidad del estator se incorpora y se activa (Fig. 6a-c). Este proceso podría verse favorecido por FliL, una proteína de membrana que recientemente se ha demostrado que mejora la incorporación estator-rotor y estabiliza la unidad del estator en su forma activada63,64. Durante la activación, cada subunidad PomA cerca del PomB D24 desacoplado suministra Na+ desde la cavidad de selectividad iónica para acoplar el D24 desacoplado con un Na+. Mientras tanto, el PomB D24 comprometido libera el Na+ acoplado y junto con M155 asegura la rotación en sentido horario de PomA alrededor de PomB visto desde el exterior de la membrana. Al mismo tiempo, el dominio citoplasmático de PomA interactúa progresivamente con la hélice de torsión FliG. El rotor estará en modo de rotación CCW o CW, dependiendo de la conformación del anillo C (Fig. 6d).

a Una unidad de estator inactiva está obstruida y autoinhibida. b La unidad del estator inactivo orienta su dominio citoplasmático hacia el rotor para hacer contacto con la hélice de torsión FliG. c La señal de la interacción entre la unidad del estator y el rotor se transfiere al dominio periplásmico de PomAB, donde promueve la liberación de los motivos del tapón, seguida de la dimerización de los motivos PomB PGB y su unión a la capa de peptidoglicano. PomAB se activa. d En el PomAB activado, un ion sodio (representado por una esfera con un símbolo +) pasa a través del filtro de unión selectiva de PomA y se une a PomB Asp24, lo que desencadena la rotación CW de PomA alrededor de PomB. El rotor puede girar en dirección CW o CCW, dependiendo de cómo interactúa con la unidad del estator. e Desmontaje de la unidad del estator del rotor cuando se reduce el par externo.

Dado el hecho de que las unidades de estator se ensamblan y desmontan constantemente alrededor del rotor, dependiendo del requisito de carga externa, el dominio citoplásmico asimétrico de PomA también podría ser ventajoso para que la unidad de estator desactivada se separe del rotor. Cuando la carga externa disminuye, lo que probablemente promueve que el motivo PGB del PomB se desconecte de la pared celular, los motivos de enchufe de la unidad del estator se vuelven a unir a sus sitios inhibidores. Esta señal se transferirá al dominio citoplasmático de la unidad del estator, lo que provocará su asimetría y debilitará las interacciones entre la unidad del estator y el rotor, lo que promoverá que la unidad del estator se separe del rotor (Fig. 6e). El modelo propuesto recuerda al mecanismo de "enlace de captura" propuesto recientemente, en el que la interacción/enlace se vuelve más débil bajo una fuerza reducida y se mejora con la rotación del rotor65,66. Sin embargo, la estructura atómica de todo el motor flagelar con las unidades de estator ensambladas es necesaria para comprender completamente el mecanismo de incorporación del rotor de la unidad de estator y queda por investigar más a fondo si el dominio citoplasmático asimétrico de PomA se vuelve simétrico durante la activación (Figuras complementarias 15a-b). .

En resumen, presentamos las estructuras de VaPomAB tanto en ambientes detergentes como lipídicos. Los mapas crio-EM no solo proporcionan un ensamblaje estructural detallado de la unidad del estator impulsada por Na+, sino que también nos permiten asignar los sitios de unión de iones, lo que a su vez nos permite abordar el enigmático mecanismo de la selectividad iónica de la unidad del estator. Nuestro análisis estructural y experimentos funcionales respaldan que la unidad del estator es un motor rotativo unidireccional CW y esto se logra mediante un punto de "refuerzo" de rotación direccional hidrófobo. La organización de los motivos del enchufe PomB y el descubrimiento del motivo helicoidal del terminal C de PomA amplían aún más nuestra visión sobre la activación de la unidad del estator y la incorporación del rotor.

La secuencia de ADN que codifica VaPomAB se amplificó a partir de Vibrio alginolyticus (ATCC 17749) y se subclonó en un vector pET modificado que contenía una etiqueta Strep gemela C-terminal. Se insertó un sitio de escisión de proteasa 3C de rinovirus humano (HRV) (GTLEVLFQGPGGS) entre el motivo del tapón PomB y el dominio de unión de peptidoglicano (entre los residuos Gln95 y Gln96). El complejo PomAB se expresó en células E. coli OverexpressTM C43(DE3) (LuBioScience GmbH). Las células se cultivaron en 8 l de medio LB suplementado con 50 μg/ml de ampicilina a 37 °C y la expresión de proteínas se indujo con IPTG 0,5 mM a OD600 0,6. Las células se incubaron durante otras 16 h a 20 °C antes de la recolección. El sedimento celular se resuspendió en tampón A (HEPES 20 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM) con 30 μg/ml de DNasa I y 50 μg/ml de lisozima y se incubó a 4 °C durante 30 minutos antes de pasarlo a través de un EmulsiFlex- Homogeneizador C5 a 15 000-20 000 libras de fuerza por pulgada cuadrada. Luego, las membranas se sedimentaron a 18.000 × g durante 1 h y se almacenaron a -20 ° C después de la congelación instantánea con nitrógeno líquido.

Para la purificación de proteínas, las membranas se solubilizaron en tampón A suplementado con lauril maltosa neopentilglicol (LMNG) al 2 % (p/v), glicerol al 10 % e inhibidores de proteasa (tabletas de cóctel de inhibidores de proteasa, sin EDTA, Roche Diagnostics GmbH) durante 2 h a 4 ° C mientras se agita sobre una plataforma oscilante, y luego se ultracentrifuga durante 30 min a 18.000 × g. El sobrenadante se añadió a una columna de flujo por gravedad que contenía 2 ml de resina Strep-Tactin® Superflow® (IBA) preequilibrada con tampón de lavado (tampón A con 10 % de glicerol y 0,005 % de LMNG). Las resinas se lavaron cinco veces con 4 volúmenes de columna de tampón de lavado y la proteína marcada con Strep se eluyó con tampón de elución (Tampón A, glicerol al 10 %, LMNG al 0,005 % y destiobiotina 10 mM). Luego se concentró el complejo proteico hasta alcanzar un volumen de 0,5 ml. Se añadió proteasa HRV-3C a la muestra de VaPomAB, con una relación proteína:proteasa de 5:1 (p/p) y se incubó a 4 °C durante la noche. La muestra se cargó en una columna Superose® 6 Incremento 10/300 GL (Merck), preequilibrada con tampón A con LMNG al 0,002 %. Las fracciones máximas correspondientes al complejo proteico se concentraron a aproximadamente 16-20 mg/ml usando un filtro centrífugo con una membrana de PES (Sartorius) y se usaron para la preparación de rejillas de muestra crio-EM inmediatamente.

Para reconstituir VaPomAB en nanodiscos lipídicos con MSP1D1, se mezclaron 500 µl de VaPomAB purificado 2 mg/ml sin PomB PGB con lípidos polares de E. coli y MSP1D1 en una proporción molar de 1:156:6,25 (VaPomAB:lípidos:MSP1D1). La reacción se incubó a 4 °C con agitación suave durante 5 min. Se agregaron bioperlas (300 mg por ml de reacción) y se incubaron durante la noche para eliminar el detergente. Las bioperlas se filtraron al día siguiente utilizando un tubo de filtro centrífugo de PVDF de 0,22 μm (Durapore). Luego, la muestra se inyectó en una columna Superose® 6 Incremento 10/300 GL (Merck), que se preequilibró con tampón A. Las fracciones de pico correspondientes al complejo proteico en nanodiscos lipídicos de MSP1D1 se combinaron, concentraron y usaron para crio. -Preparación de rejillas EM.

Para reconstituir VaPomAB en nanodiscos de lípidos con saposina, se mezclaron 300 μl de VaPomAB purificado de longitud completa de 6 mg / ml (sin inserción de proteasa) con lípidos polares de E. coli (10 mM; 200 μl) y se incubaron a temperatura ambiente durante 10 min. Se añadió saposina (6,7 mg/ml; 350 µl) a la reacción y se incubó durante 2 minutos. La relación molar de PomAB, lípidos y saposina fue de 1:300:35, respectivamente. La reacción se diluyó con 2 ml de tampón A para iniciar la reconstitución y se incubó en hielo durante 30 minutos más. Se agregaron 700 mg de bioperlas y se incubaron durante la noche para eliminar el detergente. El resto de los pasos fueron los mismos que cuando se reconstituyó VaPomAB en nanodiscos MSP1D1.

Para romper la orientación preferencial de las partículas, se añadió CHAPSO al 0,0125 % (concentración final) a la muestra antes de la preparación de la rejilla. Se aplicaron 2,7 µl de muestra recién purificada sobre rejillas descargadas luminiscentemente (30 s, 5 mA) (Quantifoil R 0,6/1 300 mesh Cu o Ultrafoil 0,6/1 300 mesh Au) y se congelaron por inmersión en etano líquido utilizando un Vitrobot Mark IV. (FEI, Thermo Fisher Scientific) con los siguientes parámetros: 4 °C, 100 % de humedad, tiempo de espera de 7 s, tiempo de transferencia de 4 a 4,5 s y una fuerza de transferencia de 25. Las películas se recopilaron utilizando el programa de adquisición semiautomática EPU. (FEI, Thermo Fisher Scientific) en un microscopio Titan Krios G2 operado a 300 keV emparejado con un detector de electrones directo Falcon 3EC (FEI, Thermo Fisher Scientific). Las imágenes se grabaron en modo de conteo de electrones, con un aumento de 96.000x con un tamaño de píxel calibrado de 0,832 Å y un rango de desenfoque de 0,8 a 3 µM. Para la muestra de VaPomAB purificada en LMNG, se recolectaron 6467 micrografías, cada una de las cuales contenía 40 fotogramas y una dosis de exposición total de 37,98 (e/Å2). Para la muestra de VaPomAB reconstituida en nanodiscos de saposina, se recolectaron 3927 micrografías, cada una de las cuales contenía 40 fotogramas y una dosis de exposición total de 37 (e/Å2). Para la muestra VaPomAB MSP1D1, se recolectaron 5450 micrografías, cada una de las cuales contenía 40 fotogramas y una dosis de exposición total de 40 (e/Å2).

Para mantener coherente el procesamiento de datos de imágenes, todos los conjuntos de datos se procesaron utilizando cryoSPARC versión 3.3.2 y versión 4, a menos que se indique lo contrario. Se utilizó la corrección del movimiento del parche para estimar y corregir el movimiento del cuadro y la deformación de la muestra (movimiento local). Se utilizó la estimación de la función de contraste de parche (CTF) para ajustar el CTF local a las micrografías. Las micrografías se seleccionaron manualmente para eliminar las malas (espesor de hielo relativamente superior a 1,05 y valor de CTF inferior a 3,2 Å para el conjunto de datos de LMNG; espesor de hielo relativamente superior a 1,1 y valor de CTF inferior a 5 Å para el conjunto de datos de nanodiscos MSP1D1; espesor de hielo relativamente superior a 1,2 y valor de CTF peor que 5 Å para el conjunto de datos de nanodiscos Saposin). Las partículas se recogieron utilizando el software Topaz implementado en cryoSPARC67. Básicamente, el extracto de topacio se utilizó con un modelo previamente entrenado con un valor umbral de partículas previamente probado. Las partículas se extrajeron con un tamaño de cuadro de 400 píxeles y un recorte de Fourier a un tamaño de cuadro de 100 píxeles. Las partículas duplicadas se eliminaron utilizando un criterio de distancia de separación mínima de 60 Å, lo que significa que la distancia entre los centros de dos partículas vecinas debe ser mayor que 60 Å. Luego se realizó una ronda de clasificación 2D, seguida de reconstrucción ab-initio. Se utilizó un refinamiento heterogéneo para eliminar las partículas basura. Las partículas se volvieron a extraer con el tamaño de caja completo (400 píxeles). Se aplicó un refinamiento no uniforme con una máscara dinámica para obtener un mapa de alta resolución. Además, se realizó un refinamiento local con una máscara suave que rodea el complejo VaPomAB para lograr un mapa de mayor resolución. La cantidad de micrografías, los valores de exposición total, la cantidad de partículas utilizadas para el refinamiento final y los valores de resolución del mapa para todos los conjuntos de datos se resumen en la Tabla S1.

Se utilizó ColabFold68 para predecir la estructura del pentámero PomA69 y ajustar manualmente el modelo a la densidad utilizando UCSF ChimeraX70. El modelo se perfeccionó en Coot71, y PomB TM y el motivo del enchufe se modelaron manualmente. Luego, el modelo se perfeccionó con respecto al mapa utilizando el refinamiento del espacio real PHENIX72.

El sistema se construyó incorporando la estructura crio-EM de PomAB en una bicapa lipídica mixta y plana que consta de fosfatidiletanolamina (POPE) 16:0-18:1 y 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidilglicerol (POPG) en una proporción de 4:1. relación utilizando la herramienta Membrane Builder del servidor web CHARMM-GUI73. Se añadió agua explícita utilizando el modelo de agua TIP3P y la carga del sistema se neutralizó con iones de sodio y se solvató en una caja de agua cúbica que contenía NaCl 0,15 M. El tamaño de la caja era de 11,0, 11,0 y 11,5 nm en las dimensiones x, y y z, respectivamente, lo que dio como resultado ~144.000 átomos en total. El campo de fuerza CHARMM36m74 se usó para la proteína y el campo de fuerza de lípidos CHARMM3675 se usó para todas las moléculas de lípidos. Tenga en cuenta que la corrección WYF se incluyó en el campo de fuerza para mejorar la descripción de las interacciones catión-π76. La temperatura se mantuvo constante a 310 K usando el algoritmo V-rescale con una constante de acoplamiento de 2 ps, y la presión a 1,0 bar usando el barostato Parrinello-Rahman77 con una constante de acoplamiento de tiempo de 5 ps. Se aplicó un límite de 1,2 nm para las interacciones de van der Waals utilizando una función de cambio que comienza en 1,0 nm. El límite para las interacciones electrostáticas de corto alcance también fue de 1,2 nm y las interacciones electrostáticas de largo alcance se calcularon mediante el algoritmo de descomposición de malla de partículas de Ewald con un espaciado de malla de 0,12 nm. Se utilizó una cuadrícula recíproca de 96 × 96 × 96 celdas con interpolación B-spline de cuarto orden. Las simulaciones de MD se realizaron con Gromacs2021.578. Se realizaron dos simulaciones independientes, cada una de un µs. El análisis de las trayectorias MD se realizó utilizando las herramientas Gromacs gmx y GROmaρs79.

La diferencia relativa de energía libre entre Na+ y K+ en la cavidad de unión de sodio (el sitio de unión derecho en la Fig. 4d) se calculó utilizando el método de perturbación de energía libre80. Para las transformaciones alquímicas de los tipos de átomos se preparó una topología híbrida que contiene ambos iones. Para simplificar el cálculo, se utilizó una configuración de 'sistema doble/caja única'81, de modo que se pudiera obtener ΔΔGbindingN+→K+ en un único conjunto de cálculos. Las transiciones alquímicas se realizaron con trece ventanas lambda y cada ventana se ejecutó durante 4 ns. El cálculo se repitió 3 veces para confirmar la coherencia. Se utilizó Gromacs 2021.5 para realizar las simulaciones alquímicas y la herramienta gmx bar para analizarlas.

Escherichia coli y Salmonella enterica serovar Typhimurium LT2 (J. Roth) (ATCC 700720) se cultivaron a 37 °C con aireación a 180 rpm en caldo de lisogenia (medio LB) [10 g/l de triptona, 5 g/l de extracto de levadura y 5 g/l NaCl]. Para las placas de agar sólido, se añadió 1,5 % (p/v) de agar-agar; alternativamente, para probar la motilidad de natación, se complementó con 0,3 % (p/v) de agar-agar. Todas las cepas utilizadas en este estudio se enumeran en la información del suplemento, Tabla S2. Para las cepas que albergan un plásmido que porta un marcador de resistencia, los medios seleccionados se suplementaron con cloranfenicol (12,5 µg/ml). Los experimentos de inducción se realizaron en presencia de arabinosa (0,2%).

Los plásmidos se construyeron según técnicas de clonación estándar como se describe en otra parte (ISBN 0879695773). En resumen, se aplicaron PCR en círculo rodante alrededor del cuerno y PCR de superposición para generar mutaciones puntuales en pomA o pomB, respectivamente. Los cebadores utilizados en este estudio se enumeran en la información del suplemento, Tabla S3. Para la amplificación del ADN se utilizó la polimerasa Q5 y ​​para la verificación la polimerasa OneTaq (ambas adquiridas en NEB, Ipswich, MA, EE. UU.). Todos los plásmidos fueron verificados mediante secuenciación.

Para evaluar la motilidad de natación de los mutantes VaPotAB, se inocularon cepas en medio líquido LB suplementado con cloranfenicol y se cultivaron durante la noche. Se inocularon 2 µl de los cultivos de la noche a la mañana en placas de agar blando que contenían el marcador selectivo y se complementaron con o sin arabinosa y se incubaron a 37 °C. Una vez que se hizo visible un halo de motilidad, se escanearon las placas. A partir de estas imágenes, se midieron los diámetros de nado utilizando Fiji82.

Las figuras se prepararon utilizando ChimeraX 1.6.170, PyMOL 2.5.4, GraphPad Prisim 9.4.1 y Adobe Illustrator. El área superficial enterrada y la energía libre de solvatación se calcularon utilizando el servidor web en línea PDBePISA83. La comparación estructural entre los modelos PomAB-LMNG y PomAB-MSP1D1 se realizó en Pymol alineando 1312 átomos de Cα, sin rechazo de valores atípicos. Los mapas de potencial electrostático se calcularon utilizando el complemento electrostático APBS84 integrado dentro de Pymol. Brevemente, el modelo de alta resolución VaPomAB y el modelo VaFliG AlphaFold se prepararon utilizando “pdb2pqr”85 asignando cargas parciales e hidrógenos, así como átomos faltantes. Luego, los mapas electrostáticos se calcularon utilizando APBS con un espaciado de cuadrícula de 0,5. El mapa calculado se proyectó sobre la molécula correspondiente con la escala dada en unidades KbT/e, donde Kb representa la constante de Boltzmann, T es la temperatura en Kelvin y e es la carga de un electrón. Hemos proporcionado en la Fig. 16 complementaria. Los geles SDS sin recortar y sin procesar presentados en la Fig. 2b complementaria, Figs. 3a y 4a.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las coordenadas atómicas de VaPomAB en detergente LMNG y VaPomAB en nanodisco MSP1D1 se depositaron en el Protein Data Bank con los códigos de acceso PDB: 8BRD y 8BRI, respectivamente. Los mapas de potencial electrostático correspondientes se depositaron en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) con los códigos de acceso EMDB: EMD-16212 y EMD-16215, respectivamente. El mapa de potencial electrostático para VaPomAB de longitud completa en nanodiscos de Saposina se depositó en EMDB con el código de acceso EMDB: EMD-16214. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Zheyi Liu y Yong Wang

Base Provincial de Cooperación Internacional en Ciencia y Tecnología en Ingeniería Biológica, Campus Internacional de la Universidad de Zhejiang, Haining, 314400, China

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NMIT y HH concibieron el proyecto y diseñaron experimentos. HH expresó, purificó, optimizó, preparó rejillas crio-EM, recopiló datos crio-EM y determinó la estructura de VaPomAB y las estructuras de VaPomAB en nanodiscos. MS ayudó con la expresión de proteínas, la purificación y la preparación de la red crio-EM al comienzo de este proyecto. PFP realizó el ensayo de motilidad y junto con ME interpretaron los datos. YW y ZL realizaron las simulaciones de dinámica molecular. MS, AR-E., YMY y FJOM ayudaron con el análisis de datos y la preparación de figuras. NW ayudó con la interpretación de los datos. HH construyó y perfeccionó los modelos de estructura, preparó figuras y escribió el primer borrador del manuscrito con aportes de todos los autores, que luego fue editado por NMIT y ME. Todos los autores contribuyeron a la revisión del manuscrito.

Correspondencia a Nicholas MI Taylor.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Un archivo de revisión por pares está disponible.

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Hu, H., Popp, PF, Santiveri, M. et al. Selectividad iónica y acoplamiento del rotor de la unidad de estator flagelar Vibrio impulsada por sodio. Nat Comuna 14, 4411 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-39899-z

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Recibido: 15 de enero de 2023

Aceptado: 04 de julio de 2023

Publicado: 27 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-023-39899-z

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